Cdk4 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400148-ACT

Das humane CDK4-Gen kodiert die Cyclin-abhängige Kinase 4 (Cdk4), einen zentralen Regulator des Fortschreitens durch die G1-Phase, der mit D-Typ-Cyclinen zusammenwirkt, um Proteine der RB-Familie zu phosphorylieren und die für den Eintritt in die S-Phase erforderliche, E2F-abhängige Transkription zu fördern. Die CDK4-Aktivität ist in mitogene Signalwege eingebunden, darunter die Rezeptor-Tyrosinkinase–RAS–MAPK- und die PI3K–AKT-Achse, und wird durch CDK-Inhibitoren wie CDKN2A (p16INK4A) moduliert. Eine fehlregulierte CDK4-Signalgebung stört die Kontrolle der Zellzyklus-Checkpoints und trägt zu aberranten Proliferationsprogrammen bei, die für die Krebsbiologie relevant sind, während sie zugleich Linienentscheidungen und metabolische Umprogrammierung in proliferierenden Zellen beeinflusst. Als Knotenpunkt-Kinase im Cyclin-D–CDK4/6–RB-Signalweg dient CDK4 als breit genutzter molekularer Ansatzpunkt, um Wachstumssteuerung und die Kopplung des Zellzyklus an Transkription zu untersuchen.

Cdk4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CDK4-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Cdk4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CDK4-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CDK4-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Cdk4-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CDK4-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Cdk4-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Cdk4-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CDK4-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.