Plasmide CRISPR d'Activation (h) CDD: sc-403915-ACT

Le gène humain **CDA** code la cytidine désaminase (CDD), une enzyme dépendante du zinc qui catalyse la désamination de la cytidine et de la désoxycytidine en uridine et désoxyuridine, respectivement, contribuant ainsi au recyclage des pyrimidines et à l’homéostasie des nucléosides. En régulant les réserves intracellulaires de nucléosides, la CDD influence la capacité de réplication et de réparation de l’ADN et peut moduler les réponses cellulaires à l’exposition aux analogues nucléosidiques via leur inactivation métabolique. L’activité de la CDA s’inscrit dans des réseaux plus larges du métabolisme des nucléotides, qui façonnent la prolifération, la tolérance au stress réplicatif et l’équilibre mitochondrie–noyau de la disponibilité des dNTP. Une expression ou une activité dérégulée de la CDA/CDD a été associée à des phénotypes de métabolisme des nucléosides altérés, pertinents pour la biologie du cancer, la fonction des cellules immunitaires et les variations héréditaires des voies du métabolisme des médicaments, ce qui en fait un nœud utile pour des études mécanistiques.

CDD Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CDA sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

CDD Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CDA dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CDA, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de CDD. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CDA natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de CDD au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie CDD dans les cellules tumorales présentant une expression de CDA silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.