Cdc50A CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403231-ACT

TMEM30A kodiert die menschliche Cdc50A‑Untereinheit von P4‑ATPase‑Phospholipid‑Flippase‑Komplexen, die die Phospholipid‑Asymmetrie der Plasmamembran aufrechterhalten, indem sie Aminophospholipide über Doppelschichten hinweg translozieren. Durch die Unterstützung des vesikulären Transports, der Endozytose und des Recyclings von Membranproteinen beeinflusst Cdc50A die Zellpolarität, apoptotische Signalwege im Zusammenhang mit der Exposition von Phosphatidylserin sowie lipidabhängige Signal‑Mikrodomänen. Eine Störung der TMEM30A/Cdc50A‑abhängigen Lipidhomöostase wurde mit verändertem Rezeptor‑Turnover, Entzündungsreaktionen und zellulären Stressphänotypen in Verbindung gebracht, die für Neurobiologie, Immunität und krebsassoziiertes Membran‑Remodeling relevant sind. Diese Funktionen machen Cdc50A zu einem nützlichen Ansatzpunkt für die Untersuchung von Membranasymmetrie, Transportwegen und lipidregulierten Signalnetzwerken in menschlichen Zellen.

Cdc50A Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TMEM30A-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Cdc50A Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TMEM30A-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TMEM30A-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Cdc50A-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TMEM30A-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Cdc50A-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Cdc50A-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TMEM30A-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.