Cdc16 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404163-ACT

CDC16 codifica a Cdc16, uma subunidade central do complexo promotor da anáfase/ciclossomo (APC/C), que atua como uma ligase E3 de ubiquitina e controla a proteólise ordenada durante a mitose e a fase G1. Ao sustentar a montagem do APC/C e o reconhecimento de substratos, a Cdc16 contribui para a degradação oportuna de ciclinas e de outros reguladores do ciclo celular, garantindo a fidelidade do checkpoint do fuso e a segregação cromossômica adequada. A perturbação da regulação do APC/C está associada a estresse replicativo, aneuploidia e capacidade proliferativa alterada, tornando o CDC16 relevante para estudos de estabilidade genômica e de desregulação do ciclo celular associada ao câncer. O CDC16 também é usado como um nó para dissecar o controle, pela via ubiquitina–proteassoma, da saída da mitose e da adaptação de checkpoints.

Cdc16 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CDC16 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Cdc16 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CDC16 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CDC16, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Cdc16. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CDC16 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Cdc16 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Cdc16 em células tumorais com expressão de CDC16 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.