CD133 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-437381-ACT

Prom1 kodiert das Pentaspannen-Membranglykoprotein CD133, einen Zelloberflächenmarker, der in Stamm- und Vorläuferkompartimenten zahlreicher Mausgewebe angereichert ist. CD133 lokalisiert in Ausstülpungen der Plasmamembran und wird mit der Regulation der Zellpolarität, der Membranorganisation sowie von Signalprogrammen in Verbindung gebracht, die Selbsterneuerung und Linienfestlegung beeinflussen, darunter Wnt/β-Catenin, PI3K–AKT, Notch und Hedgehog-assoziierte Prozesse. Eine veränderte PROM1/CD133-Expression wird in unterschiedlichen Krebsmodellen häufig mit Phänotypen tumorinitiierender Zellen, metastatischem Potenzial und Signaturen der Therapieresistenz assoziiert; zudem wird sie im Kontext der Geweberegeneration und der Neuroentwicklung untersucht. In Maus-Systemen bietet Prom1 einen gut nutzbaren Ansatzpunkt, um mithilfe genetischer Perturbationsstrategien stammzellähnliche Zustände, epitheliale Organisation und Differenzierungsverläufe zu untersuchen.

CD133 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Prom1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

CD133 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Prom1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Prom1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen CD133-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Prom1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von CD133-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des CD133-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Prom1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.