Plásmido CRISPR de Activación (h) CCDC109B: sc-412415-ACT

MCUB (CCDC109B) codifica una subunidad reguladora del complejo del uniportador mitocondrial de calcio que modula la entrada de Ca2+ a través de la membrana mitocondrial interna y ayuda a ajustar la bioenergética mitocondrial y la señalización dependiente de Ca2+. Al actuar como regulador negativo de la actividad del canal MCU, CCDC109B influye en la fosforilación oxidativa, el equilibrio de especies reactivas de oxígeno y el acoplamiento entre los transitorios de Ca2+ citosólico y el metabolismo mitocondrial. La regulación alterada del uniportador se ha vinculado con respuestas desreguladas al estrés celular y con la remodelación de la dinámica mitocondrial, procesos relevantes para fenotipos proliferativos y neurodegenerativos. En células humanas, MCUB/CCDC109B se estudia, por tanto, en el contexto de la homeostasis mitocondrial de Ca2+, la reprogramación metabólica y los programas transcripcionales impulsados por Ca2+.

CCDC109B El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de MCUB sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

CCDC109B El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus MCUB en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional MCUB, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de CCDC109B. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo MCUB y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de CCDC109B en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía CCDC109B en células tumorales con expresión de MCUB silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.