CBP80 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403736-ACT

NCBP1 kodiert die menschliche Untereinheit des Cap-Binding-Komplexes CBP80, eine zentrale Komponente des nukleären Cap-Binding-Komplexes, der die 7‑Methylguanosin-Kappe an neu entstehenden Transkripten der RNA-Polymerase II erkennt. CBP80 koordiniert mehrere Schritte der mRNA-Biogenese, darunter das Spleißen von Prä‑mRNA, die 3′‑Endprozessierung, den nukleären Export sowie die Pionier‑Translationsrunde, und ist mit Überwachungswegen wie dem nonsense-vermittelten mRNA-Abbau (NMD) verknüpft. Über diese Funktionen verbindet NCBP1 den transkriptionellen Output mit der RNA-Qualitätskontrolle und der Proteom-Homöostase in proliferierenden wie auch differenzierten Zellzuständen. Eine Fehlregulation cap-abhängiger RNA-Prozessierung und des Exports ist breit relevant für onkogene Transkriptionsprogramme und neuroentwicklungsbezogene Phänotypen, was CBP80 zu einem nützlichen Knotenpunkt macht, um den RNA-Stoffwechsel in krankheitsrelevanten Modellen zu untersuchen.

CBP80 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen NCBP1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

CBP80 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des NCBP1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der NCBP1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen CBP80-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native NCBP1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von CBP80-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des CBP80-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem NCBP1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.