Plasmide CRISPR d'Activation (h) CBP20: sc-404124-ACT

Le gène humain NCBP2 code CBP20, la petite sous-unité du complexe nucléaire de liaison à la coiffe, qui reconnaît la coiffe 7‑méthylguanosine des transcrits naissants produits par l’ARN polymérase II. Par son association avec CBP80 et ses interactions avec des facteurs d’épissage, d’export des ARNm et de surveillance des ARN, CBP20 contribue à coordonner la maturation des pré‑ARNm, l’acquisition de la compétence à l’export nucléaire et des voies de contrôle qualité telles que la dégradation médiée par les codons non-sens (NMD). La reconnaissance de la coiffe dépendante de CBP20 influence les programmes d’expression génique au cours de la progression du cycle cellulaire et des réponses au stress en modulant la maturation et la stabilité des transcrits. Le dérèglement du traitement et de l’export des ARN dépendants de la coiffe est fréquemment associé à des phénotypes de prolifération et de maintien du génome altérés, ce qui fait de NCBP2 une cible pertinente pour des études mécanistiques du métabolisme des ARN dans des contextes liés à la maladie.

CBP20 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de NCBP2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

CBP20 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus NCBP2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription NCBP2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de CBP20. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus NCBP2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de CBP20 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie CBP20 dans les cellules tumorales présentant une expression de NCBP2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.