Plásmido CRISPR de Activación (h) cathepsin D: sc-400207-ACT

CTSD codifica la catepsina D, una endopeptidasa aspártica lisosomal esencial para el recambio intracelular de proteínas y el procesamiento de antígenos a través del sistema endo-lisosomal. Al modular la proteólisis mediada por lisosomas y el flujo de la vía autofagia-lisosoma, la catepsina D influye en la homeostasis celular, las respuestas al estrés y la remodelación de sustratos proteicos extracelulares e intracelulares. La expresión o actividad desregulada de CTSD se ha relacionado con neurodegeneración, inflamación y biología tumoral, donde la alteración de la función lisosomal puede afectar a la apoptosis, la adaptación metabólica y los fenotipos invasivos. En consecuencia, CTSD se estudia ampliamente en vías que regulan la biogénesis lisosomal, la proteostasis y el tráfico endocítico.

cathepsin D El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de CTSD sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

cathepsin D El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus CTSD en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional CTSD, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de cathepsin D. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo CTSD y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de cathepsin D en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía cathepsin D en células tumorales con expresión de CTSD silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.