Plasmide CRISPR d'Activation (h) cathepsin B: sc-400360-ACT

CTSB code la protéase cystéine lysosomale cathepsine B, un médiateur clé du renouvellement intracellulaire des protéines et du remodelage endolysosomal. La cathepsine B participe au catabolisme dépendant des lysosomes, au dialogue entre autophagie et lysosomes, et au traitement régulé des protéines au sein des compartiments endocytiques, avec des rôles supplémentaires dans le renouvellement de la matrice extracellulaire lorsqu’elle est sécrétée ou relocalisée. Des altérations de l’expression ou de l’activité de CTSB ont été associées à des modifications du traitement des antigènes, des réponses liées à l’inflammasome et des voies de stress de la protéostasie qui influencent la survie cellulaire et le remodelage tissulaire. La dérégulation de la cathepsine B est fréquemment étudiée dans le contexte de l’invasion et des métastases cancéreuses, de la neurodégénérescence et des troubles inflammatoires, où des changements de la fonction lysosomale et de l’équilibre des protéases contribuent à des phénotypes pertinents pour la maladie.

cathepsin B Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CTSB sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

cathepsin B Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CTSB dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CTSB, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de cathepsin B. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CTSB natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de cathepsin B au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie cathepsin B dans les cellules tumorales présentant une expression de CTSB silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.