caspase-8 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400147-ACT

Humanes CASP8 kodiert Caspase-8, eine initiatorische Cysteinprotease, die die Aktivierung von Todesrezeptoren mit nachgeschalteten Caspase-Kaskaden und regulierten Zelltodprogrammen koppelt. Sie wirkt am DISC (death-inducing signaling complex), um die extrinsische Apoptose weiterzuleiten, und greift über Interaktionen mit FADD, cFLIP, RIPK1 und RIPK3 in die Kontrolle der Nekroptose ein, wodurch Entzündungs- und Stressantworten geprägt werden. CASP8 beeinflusst außerdem die Immun-Signalgebung und Zellschicksalsentscheidungen downstream von TNFR- und Fas-Signalwegen, mit kontextabhängigen Effekten auf Zytokinproduktion und Überleben. Eine Fehlregulation der Aktivität oder Expression von Caspase-8 wurde mit veränderter Apoptose-Empfindlichkeit, Immunstörungen und einer für Krebs relevanten Umgehung von Zelltodmechanismen in Verbindung gebracht.

caspase-8 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CASP8-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

caspase-8 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CASP8-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CASP8-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen caspase-8-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CASP8-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von caspase-8-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des caspase-8-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CASP8-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.