caspase-14 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402687-ACT

Human CASP14 kodiert Caspase-14, eine atypische Caspase, die überwiegend mit der epidermalen Differenzierung und nicht mit der klassischen apoptotischen Signalgebung in Verbindung steht. Caspase-14 unterstützt die terminale Reifung von Keratinozyten und die Bildung des Stratum corneum, indem sie zu Verhornungsprozessen und zur Barrierehomöostase beiträgt, einschließlich proteolytischer Vorgänge im Zusammenhang mit der Filaggrin-Prozessierung und der Bildung des natürlichen Feuchthaltefaktors (Natural Moisturizing Factor, NMF). Eine veränderte CASP14-Expression oder -Aktivität wurde mit einer beeinträchtigten Hautbarrierefunktion und entzündlichen Hautphänotypen in Zusammenhang gebracht, was CASP14 für Studien zu Keratinisierung, Barriereintegrität und Stressantworten in epithelialen Geweben relevant macht. Im Kontext der umfassenderen Caspase-Familie bietet CASP14 zudem einen nützlichen Ansatzpunkt, um nicht-apoptotische Proteasefunktionen in differenzierungsassoziierten Signalwegen zu untersuchen.

caspase-14 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CASP14-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

caspase-14 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CASP14-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CASP14-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen caspase-14-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CASP14-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von caspase-14-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des caspase-14-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CASP14-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.