Calpain 8 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402847-ACT

Das humane Gen **CAPN8** kodiert Calpain 8, eine calciumabhängige Cysteinprotease der Calpain-Familie, die kontextabhängig zur regulierten Proteolyse und zum Proteinumsatz beiträgt. Durch die Modulation der Spaltung ausgewählter Substrate kann Calpain 8 den Umbau des Zytoskeletts, den Membrantransport und Signaltransduktionsereignisse beeinflussen, die zelluläre Stressantworten und Differenzierungsprogramme prägen. Die calpainvermittelte Prozessierung greift in Calcium-Signalnetzwerke und Proteostase-Wege ein, die die Anpassung an Umweltreize koordinieren. Eine fehlregulierte Calpain-Aktivität wurde mit entzündlichen Prozessen und der Pathobiologie von Epithelgeweben in Verbindung gebracht, wodurch CAPN8 ein nützliches Ziel für mechanistische Studien zur proteaseabhängigen Regulation in menschlichen Zellen darstellt.

Calpain 8 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CAPN8-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Calpain 8 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CAPN8-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CAPN8-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Calpain 8-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CAPN8-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Calpain 8-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Calpain 8-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CAPN8-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.