Calpain 5 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403881-ACT

CAPN5 kodiert Calpain 5, eine calciumabhängige Cysteinprotease, die an der regulierten Proteolyse beteiligt ist und die Zytoskelettdynamik, den Membrantransport und die Signaltransduktion mitprägt. Die Calpain-Aktivität kann Signalwege beeinflussen, die mit Zellmotilität, Adhäsion und Stressantworten verknüpft sind, indem strukturelle und signalgebende Proteine gezielt und in begrenztem Umfang gespalten werden. Eine Fehlregulation der Calpain-Proteasefunktion wurde mit entzündlichen und neurodegenerativen Prozessen in Verbindung gebracht; zudem wurden CAPN5-Varianten im Zusammenhang mit Phänotypen der Netzhautdegeneration untersucht. Eine Modulation der CAPN5-Expression ist daher nützlich, um proteasegetriebene Umbauprozesse und calciumresponsive Signalprogramme in menschlichen Zellen zu analysieren.

Calpain 5 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CAPN5-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Calpain 5 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CAPN5-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CAPN5-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Calpain 5-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CAPN5-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Calpain 5-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Calpain 5-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CAPN5-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.