CAF-1 p60 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-405091-ACT

CHAF1B kodiert die p60‑Untereinheit des Chromatin-Assembly-Faktors 1 (CAF‑1), eines Histon-Chaperons, das H3–H4 während der replikationsgekoppelten Nukleosomenassemblierung auf neu synthetisierte DNA auflädt. Durch die Koordination mit PCNA an Replikationsgabeln und während der Nukleotidexzisionsreparatur unterstützt CAF‑1 die Wiederherstellung der Chromatinstruktur, die epigenetische Vererbung und die Genomstabilität nach DNA-Synthese und -Schädigung. Eine Störung der durch CHAF1B gesteuerten Chromatinreifung kann die Antworten auf Replikationsstress, die Genauigkeit der DNA-Reparatur und Transkriptionsprogramme verändern, die mit Proliferation und Differenzierung verknüpft sind. Eine aberrante CAF‑1-Aktivität wurde mit einer Fehlregulation der Zellzykluskontrolle sowie von Signalwegen der Genomerhaltung in Verbindung gebracht, die für die Krebsbiologie und andere Erkrankungen mit Chromatinin­stabilität relevant sind.

CAF-1 p60 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CHAF1B-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

CAF-1 p60 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CHAF1B-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CHAF1B-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen CAF-1 p60-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CHAF1B-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von CAF-1 p60-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des CAF-1 p60-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CHAF1B-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.