CAF-1 p150 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402472-ACT

CHAF1A kodiert CAF-1 p150, die größte Untereinheit des Chromatin-Assembly-Factor-1-(CAF-1)-Komplexes, der während der replikationsgekoppelten Nukleosomenassemblierung die Histone H3–H4 auf neu synthetisierte DNA aufbringt. Durch die Koordination von DNA-Replikation und Chromatinwiederherstellung unterstützt CAF-1 p150 das Fortschreiten der S-Phase, die Stabilität von Replikationsgabeln und die Aufrechterhaltung epigenetischer Zustände und trägt über Interaktionen mit PCNA und DNA-Reparaturfaktoren zur Genomintegrität bei. Eine Störung der CAF-1-Funktion wird mit Replikationsstress, veränderter Heterochromatin-Organisation und aberranten Transkriptionsprogrammen in Verbindung gebracht – Prozesse, die häufig im Kontext der Biologie proliferativer Erkrankungen untersucht werden. Die CHAF1A-Aktivität ist daher relevant für Signalwege, die DNA-Schadensantworten, Chromatindynamik und Zellzykluskontrolle steuern.

CAF-1 p150 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CHAF1A-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

CAF-1 p150 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CHAF1A-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CHAF1A-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen CAF-1 p150-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CHAF1A-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von CAF-1 p150-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des CAF-1 p150-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CHAF1A-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.