Plásmido CRISPR de Activación (h) CA VIII: sc-403750-ACT

El CA8 humano codifica la anhidrasa carbónica VIII (CA VIII), una proteína relacionada con las anhidrasas carbónicas pero sin actividad catalítica, que modula la señalización neuronal en lugar de la hidratación de CO₂. La CA VIII está altamente enriquecida en el sistema nervioso central y regula la dinámica del calcio intracelular mediante su interacción con las vías del receptor de inositol 1,4,5-trifosfato, lo que influye en la excitabilidad de las células de Purkinje y en la función sináptica. La alteración de la expresión o la función de CA8 se ha asociado con fenotipos del neurodesarrollo y de coordinación motora, lo que respalda su relevancia para los circuitos cerebelosos y las redes de señalización dependientes de calcio. Como miembro no enzimático de la familia CA, la CA VIII también sirve como modelo para analizar funciones tipo andamiaje de las pseudoenzimas en la señalización celular.

CA VIII El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de CA8 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

CA VIII El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus CA8 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional CA8, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de CA VIII. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo CA8 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de CA VIII en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía CA VIII en células tumorales con expresión de CA8 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.