CA III CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403538-ACT

Humanes CA3 kodiert die Carboanhydrase III (CA III), ein zytosolisches Zink-Metalloenzym, das die reversible Hydratisierung von CO₂ zu Bicarbonat und Protonen katalysiert und so zur intrazellulären pH-Pufferung und zum Kohlenstofffluss beiträgt. CA III wird stark in Skelettmuskel und anderen oxidativen Geweben exprimiert, wo es über reaktive Cysteinreste und S‑Glutathionylierung mit metabolischer Homöostase, Redox-Gleichgewicht und Antworten auf oxidativen Stress verknüpft ist. Eine veränderte CA3-Expression wurde in Zusammenhängen der Muskelphysiologie und des metabolischen Remodelings beschrieben, was ihre Nutzung als molekularen Readout in Studien zu Myopathie, Energiestoffwechsel und stressadaptiven Programmen unterstützt. Als Bestandteil der durch Carboanhydrasen vermittelten Säure‑Basen‑Regulation stellt CA III einen gut untersuchbaren Knotenpunkt dar, um zu erforschen, wie pH-Dynamiken die Enzymaktivität, Proteostase und zelluläre Fitness beeinflussen.

CA III Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CA3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

CA III Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CA3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CA3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen CA III-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CA3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von CA III-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des CA III-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CA3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.