Plasmide CRISPR d'Activation (h) C11orf65: sc-417466-ACT

C11orf65 (chromosome 11 open reading frame 65) code une protéine humaine encore mal caractérisée, qui a été annotée comme un facteur mitochondrial candidat, avec des données de plus en plus nombreuses la reliant à l’homéostasie des organites et à la régulation bioénergétique. Sur la base de sa localisation prédite et de sa conservation, C11orf65 est souvent étudiée dans le contexte de l’expression génique mitochondriale, du soutien à la phosphorylation oxydative et des réponses au stress cellulaire qui influencent la reprogrammation métabolique. La perturbation des voies de maintien mitochondrial peut modifier la gestion des espèces réactives de l’oxygène et la sensibilité à l’apoptose, ce qui fait de C11orf65 une cible d’intérêt dans les études de phénotypes neuromusculaires et métaboliques où une dysfonction mitochondriale est impliquée. Comme les annotations fonctionnelles restent limitées, la modulation contrôlée de l’expression endogène de C11orf65 est utile pour cartographier les conséquences transcriptionnelles et protéomiques en aval.

C11orf65 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de C11orf65 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

C11orf65 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus C11orf65 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription C11orf65, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de C11orf65. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus C11orf65 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de C11orf65 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie C11orf65 dans les cellules tumorales présentant une expression de C11orf65 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.