c-Kit CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400106-ACT

Das humane KIT-Gen kodiert die Rezeptor-Tyrosinkinase c-Kit (CD117), einen Zelloberflächenrezeptor für den Stammzellfaktor, der Überleben, Proliferation, Migration und Differenzierung in hämatopoetischen Vorläuferzellen, Melanozyten, Keimzellen und Mastzellen reguliert. Die ligandvermittelte Dimerisierung und Autophosphorylierung aktiviert die Signalkaskaden PI3K–AKT, RAS–MAPK, JAK/STAT und PLCγ und integriert damit Signale, die die Festlegung von Zelllinien und die Gewebehomöostase steuern. Eine fehlregulierte KIT-Signalübertragung wird mit onkogener Transformation und abweichender Mastzellbiologie in Verbindung gebracht; eine veränderte c-Kit-Aktivität ist zudem mit Tumoren und hämatologischen Erkrankungen assoziiert, bei denen sich Rezeptorexpression oder Signaloutput verändert.

c-Kit Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen KIT-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

c-Kit Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des KIT-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der KIT-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen c-Kit-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native KIT-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von c-Kit-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des c-Kit-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem KIT-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.