BUB3 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402439-ACT

BUB3 kodiert ein zentrales Protein des Spindelassemblierungs-Kontrollpunkts (SAC), das an den Kinetochoren lokalisiert und während der Mitose die Anheftung der Mikrotubuli überwacht. Durch die Zusammenarbeit mit BUB1 und seinen Beitrag zum mitotischen Checkpoint-Komplex begrenzt BUB3 den Eintritt in die Anaphase über die Regulation der APC/C-Aktivität und unterstützt eine korrekte Chromosomentrennung. Eine Störung der von BUB3 abhängigen Checkpoint-Signalgebung kann chromosomale Instabilität und Aneuploidie fördern – Prozesse, die häufig in Studien zur Tumorentstehung und Genomstabilität untersucht werden. Daher wird BUB3 häufig als mechanistischer Ansatzpunkt genutzt, um die mitotische Genauigkeit, die Kinetochor-Signalgebung und zellzyklusabhängige Stressantworten in menschlichen Zellen zu untersuchen.

BUB3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen BUB3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

BUB3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des BUB3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der BUB3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen BUB3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native BUB3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von BUB3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des BUB3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem BUB3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.