BTEB2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401680-ACT

KLF5 (BTEB2) kodiert einen Kruppel-like-Zinkfinger-Transkriptionsfaktor, der an GC-reiche Promotorelemente bindet und so Programme reguliert, die den Zellzyklus, die epitheliale Differenzierung und den Gewebeumbau steuern. Er integriert Signale aus den MAPK/ERK- und TGF-β/SMAD-Signalwegen und koordiniert transkriptionelle Antworten, die Proliferation, Migration und die Dynamik der extrazellulären Matrix beeinflussen. Eine fehlregulierte KLF5-Aktivität wurde in mehreren Geweben mit onkogenen und entzündlichen Phänotypen in Verbindung gebracht, weshalb KLF5 häufig als zentraler Knotenpunkt zur Untersuchung der transkriptionellen Kontrolle von Wachstum und Stressantworten genutzt wird. In humanen Zellmodellen hilft die Manipulation von BTEB2 dabei, kontextabhängige genregulatorische Netzwerke und das Zusammenspiel von Signalwegen zu entschlüsseln, die krankheitsassoziierten zellulären Zuständen zugrunde liegen.

BTEB2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen KLF5-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

BTEB2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des KLF5-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der KLF5-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen BTEB2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native KLF5-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von BTEB2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des BTEB2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem KLF5-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.