Plasmide CRISPR d'Activation (h) BLM hydrolase: sc-404411-ACT

BLMH code pour la bléomycine hydrolase, une protéase neutre à cystéine qui participe au renouvellement intracellulaire des peptides et des acides aminés et contribue à la détoxification cellulaire de composés de type bléomycine. L’enzyme est impliquée dans des processus liés à la protéostase via le traitement protéolytique de peptides bioactifs et peut influencer l’équilibre rédox en modulant la thiolactone de l’homocystéine et des métabolites apparentés. L’activité de BLMH recoupe des voies qui affectent le contrôle qualité des protéines et les réponses au stress, reliant son expression à des phénotypes observés dans des cellules à prolifération rapide ou soumises à un stress métabolique. Une régulation altérée de BLMH a été associée dans la littérature à des contextes liés à la neurodégénérescence et au cancer, ce qui étaye son utilisation comme cible pour des études mécanistiques de la fonction des protéases et de la résilience cellulaire.

BLM hydrolase Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de BLMH sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

BLM hydrolase Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus BLMH dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription BLMH, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de BLM hydrolase. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus BLMH natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de BLM hydrolase au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie BLM hydrolase dans les cellules tumorales présentant une expression de BLMH silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.