BCKDE1A Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-417950-ACT

BCKDHA codifica a subunidade E1α do complexo desidrogenase de α-cetoácidos de cadeia ramificada (BCKDH), um sistema mitocondrial multienzimático que catalisa a descarboxilação oxidativa de α-cetoácidos de cadeia ramificada derivados da leucina, isoleucina e valina. Essa reação é central para o catabolismo dos aminoácidos de cadeia ramificada e conecta o estado nutricional à produção de acetil-CoA/succinil-CoA, ao balanço redox mitocondrial e ao metabolismo energético celular. A atividade do BCKDH é rigidamente regulada por fosforilação e desfosforilação, integrando sinais de BCKDK e PPM1K para modular o fluxo metabólico. A desregulação de BCKDHA e o comprometimento da função do BCKDH estão associados a erros inatos do metabolismo e são amplamente estudados no contexto de disfunção mitocondrial e de homeostase alterada de aminoácidos.

BCKDE1A O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de BCKDHA sem alterar a sequência de ADN subjacente.

BCKDE1A O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus BCKDHA em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição BCKDHA, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de BCKDE1A. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus BCKDHA nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de BCKDE1A no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via BCKDE1A em células tumorais com expressão de BCKDHA silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.