BAP31 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402421-ACT

BCAP31 kodiert das humane Protein BAP31, ein multipassiges Chaperon der Membran des endoplasmatischen Retikulums (ER), das den Transport und die Qualitätskontrolle neu synthetisierter Membranproteine reguliert. BAP31 ist am Transport vom ER zum Golgi-Apparat sowie an der ER-assoziierten Degradation (ERAD) beteiligt und verknüpft den Durchsatz des sekretorischen Weges mit Signalen der Unfolded-Protein-Response und der Aufrechterhaltung der Proteostase. Außerdem ist es an Schnittstellen von Apoptose und Kalziumhomöostase an ER–Mitochondrien-Kontaktstellen beteiligt und beeinflusst so die Empfindlichkeit der Zelle gegenüber Stress. Eine fehlregulierte BCAP31/BAP31-Funktion wurde mit veränderter Proteinverarbeitung und Zellüberlebensprogrammen in Verbindung gebracht, die in neuroentwicklungsbezogenen und onkogenen Kontexten relevant sind.

BAP31 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen BCAP31-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

BAP31 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des BCAP31-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der BCAP31-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen BAP31-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native BCAP31-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von BAP31-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des BAP31-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem BCAP31-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.