band 3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401705-ACT

SLC4A1 codifica la proteina band 3 (scambiatore anionico 1, AE1), una proteina di membrana eritrocitaria altamente abbondante che catalizza lo scambio elettroneutro Cl⁻/HCO₃⁻ per supportare il trasporto di CO₂, l’equilibrio acido–base sistemico e l’omeostasi ionica dei globuli rossi. Attraverso interazioni con il citoscheletro e con gli enzimi glicolitici, band 3 contribuisce alla stabilità della membrana, al mantenimento della forma cellulare e all’organizzazione di complessi multiproteici sulla membrana plasmatica. Nelle cellule intercalate del rene, AE1 partecipa alla gestione del bicarbonato e alla regolazione del pH, collegando SLC4A1 a vie centrali di trasporto e omeostasi. Alterazioni genetiche e funzionali di SLC4A1 sono associate a disordini della membrana dei globuli rossi e a difetti nei processi di acidificazione, rendendolo un bersaglio rilevante per studi meccanicistici nella biologia eritrocitaria e nel trasporto epiteliale.

band 3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SLC4A1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

band 3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SLC4A1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SLC4A1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di band 3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SLC4A1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da band 3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via band 3 nelle cellule tumorali con espressione di SLC4A1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.