band 3 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401705-ACT

SLC4A1 kodiert Band 3 (Anionenaustauscher 1, AE1), ein sehr häufig vorkommendes Membranprotein der Erythrozyten, das einen elektroneutralen Cl⁻/HCO₃⁻-Austausch katalysiert und damit den CO₂-Transport, die systemische Säure-Basen-Balance sowie die Ionenhomöostase der roten Blutkörperchen unterstützt. Über Interaktionen mit dem Zytoskelett und glykolytischen Enzymen trägt Band 3 zur Membranstabilität, zur Aufrechterhaltung der Zellform und zur Organisation von Multiproteinkomplexen an der Plasmamembran bei. In den interkalierten Zellen der Niere ist AE1 an der Bicarbonat-Handhabung und der pH-Regulation beteiligt und verbindet SLC4A1 mit zentralen Transport- und Homöostasewegen. Genetische und funktionelle Störungen von SLC4A1 stehen mit Erkrankungen der Erythrozytenmembran und Defekten in Ansäuerungsprozessen in Zusammenhang, was das Gen zu einem relevanten Ziel für mechanistische Studien zur Erythrozytenbiologie und zum epithelialen Transport macht.

band 3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SLC4A1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

band 3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SLC4A1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SLC4A1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen band 3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SLC4A1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von band 3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des band 3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SLC4A1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.