BAF60a CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402641-ACT

SMARCD1 kodiert BAF60a, eine zentrale Untereinheit des ATP-abhängigen SWI/SNF-(BAF)-Chromatin-Remodeling-Komplexes, der die Nukleosomenpositionierung und die Chromatinzugänglichkeit reguliert, um Transkriptionsprogramme zu steuern. BAF60a koordiniert Interaktionen zwischen Transkriptionsfaktoren und der Remodeling-Maschinerie und beeinflusst so die Festlegung von Zelllinien, die Zellzyklusprogression sowie die stimuliabhängige Genexpression, einschließlich Signalwege, die mit Entwicklung und Differenzierung verknüpft sind. Als Bestandteil des BAF-Komplexes trägt SMARCD1 zur epigenetischen Regulation von Enhancer- und Promotorzuständen bei und greift in Signalnetzwerke wie Hormonrezeptor- und Stressantwort-Transkriptionsschaltkreise ein. Eine Fehlregulation von SWI/SNF-Komponenten ist mit veränderten Chromatinzuständen verbunden, wie sie bei mehreren Krebsarten und neuroentwicklungsbezogenen Phänotypen beobachtet werden, wodurch BAF60a ein relevantes Ziel für mechanistische Studien der Transkriptionskontrolle darstellt.

BAF60a Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SMARCD1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

BAF60a Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SMARCD1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SMARCD1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen BAF60a-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SMARCD1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von BAF60a-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des BAF60a-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SMARCD1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.