BAF53 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403200-ACT

ACTL6A kodiert BAF53A, eine aktinverwandte Untereinheit des ATP-abhängigen SWI/SNF-(BAF)-Chromatin-Remodeling-Komplexes, der die Positionierung von Nukleosomen und die Zugänglichkeit für die Transkription reguliert. BAF53A unterstützt die chromatinabhängige Kontrolle des Zellzyklusfortschritts, der Lineage-/Schicksalsfestlegung und DNA-schadensabhängiger Transkriptionsprogramme, indem es mit Transkriptionsfaktoren und anderen BAF-Untereinheiten interagiert, um Enhancer- und Promotoraktivität zu koordinieren. Über seine Rolle in der epigenetischen Regulation beeinflusst ACTL6A Signalwege, die mit Proliferation und Differenzierung verknüpft sind, einschließlich Chromatinorganisation und Transkriptionsregulation durch RNA-Polymerase II. Eine dysregulierte ACTL6A-Expression und eine veränderte Zusammensetzung des BAF-Komplexes wurden in mehreren Krebszusammenhängen und mit Entwicklungsphänotypen mit aberranten Transkriptionszuständen in Verbindung gebracht, was ACTL6A zu einem nützlichen Knotenpunkt für mechanistische Studien der epigenetischen Kontrolle macht.

BAF53 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ACTL6A-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

BAF53 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ACTL6A-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ACTL6A-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen BAF53-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ACTL6A-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von BAF53-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des BAF53-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ACTL6A-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.