B7-2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-418032-ACT

Humanes CD86 (B7-2) ist ein Typ-I-Membranglykoprotein, das vorwiegend auf antigenpräsentierenden Zellen exprimiert wird und dort durch die Bindung an CD28 und CTLA-4 essenzielle kostimulatorische Signale an T-Zellen vermittelt. Durch die Integration in die T‑Zellrezeptor-Signalgebung moduliert B7-2 die Aktivierung von Lymphozyten, die Zytokinproduktion und die Differenzierung und prägt damit adaptive Immunantworten sowie die periphere Toleranz. CD86 ist an der Ausbildung der immunologischen Synapse beteiligt und trägt zu NF‑κB- sowie PI3K/AKT-gekoppelten Transkriptionsprogrammen bei, die die Aktivierungszustände sowohl des angeborenen als auch des adaptiven Immunsystems steuern. Eine fehlregulierte CD86-Expression wurde mit Autoimmunität, chronischer Entzündung, Transplantatabstoßung und Tumor-Immunevasion in Verbindung gebracht, wodurch CD86 ein häufiges Ziel in der Immunologie und in mikroenvironment-fokussierter Forschung ist.

B7-2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CD86-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

B7-2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CD86-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CD86-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen B7-2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CD86-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von B7-2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des B7-2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CD86-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.