Plasmide CRISPR d'Activation (h) AVP Receptor V2: sc-403177-ACT

AVPR2 code le récepteur humain 2 de l’arginine-vasopressine (récepteur V2 de l’AVP), un récepteur couplé aux protéines G principalement associé à Gs, qui active l’adénylate cyclase et augmente l’AMPc intracellulaire. La signalisation via l’axe AMPc/PKA régule des programmes de phosphorylation et de trafic intracellulaire qui influencent la perméabilité épithéliale à l’eau et la localisation des protéines membranaires, en s’intégrant à des processus plus larges de désensibilisation des GPCR et de recyclage endocytique. L’activité d’AVPR2 est au cœur des voies répondant à la vasopressine et constitue un système modèle pour étudier la dynamique de la signalisation des récepteurs, la régulation des seconds messagers et les réponses transcriptionnelles dépendantes du ligand. Des variations génétiques ou une expression dérégulée d’AVPR2 ont été associées à des phénotypes de déséquilibre hydrique et à des défauts de repliement/de trafic du récepteur, fournissant des liens mécanistiques avec des troubles de la fonction de concentration rénale.

AVP Receptor V2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de AVPR2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

AVP Receptor V2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus AVPR2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription AVPR2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de AVP Receptor V2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus AVPR2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de AVP Receptor V2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie AVP Receptor V2 dans les cellules tumorales présentant une expression de AVPR2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.