ATP5J CRISPR Activation Plasmid (m): sc-419251-ACT

Atp5j kodiert ATP5J (auch als F6 bekannt), eine kleine akzessorische Untereinheit der mitochondrialen F1Fo-ATP-Synthase (Komplex V), die den Zusammenbau unterstützt und die effiziente Kopplung des Protonenflusses an die ATP-Produktion während der oxidativen Phosphorylierung ermöglicht. Durch die Modulation der mitochondrialen Bioenergetik trägt ATP5J zur Aufrechterhaltung des zellulären ATP/ADP-Gleichgewichts, des mitochondrialen Membranpotenzials und der metabolischen Flexibilität bei wechselnden Energieanforderungen bei. Störungen der ATP-Synthase-Funktion und der nachgeschalteten Aktivität der Atmungskette stehen mit Phänotypen einer mitochondrialen Dysfunktion in Zusammenhang, die besonders energieintensive Gewebe betreffen und mit oxidativem Stress sowie apoptosebezogenen Prozessen verknüpft sind. In Mausmodellen wird eine veränderte mitochondriale ATP-Produktion häufig genutzt, um Mechanismen zu untersuchen, die für die Neuromuskulatur sowie die Herz- und Stoffwechselkrankheitsbiologie auf Ebene mitochondrialer Signal- und Stoffwechselwege relevant sind.

ATP5J Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Atp5j-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ATP5J Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Atp5j-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Atp5j-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ATP5J-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Atp5j-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ATP5J-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ATP5J-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Atp5j-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.