Plasmide CRISPR d'Activation (h) ATP-citrate synthase: sc-403146-ACT

ACLY code l’ATP-citrate synthase, une enzyme cytosolique qui convertit le citrate et le CoA en acétyl‑CoA et oxaloacétate, reliant ainsi le flux de carbone mitochondrial à la biosynthèse des lipides et du cholestérol. En fournissant de l’acétyl‑CoA pour la synthèse des acides gras et l’acétylation des protéines, ACLY influence la reprogrammation métabolique, l’équilibre rédox et la régulation épigénétique de l’expression génique. Ce nœud intègre des signaux provenant de la glycolyse, du cycle de l’acide tricarboxylique (TCA) et des voies de détection des nutriments afin de façonner les programmes de prolifération et de différenciation. Une activité d’ACLY dérégulée a été associée à des modifications de la lipogenèse et des profils d’acétylation observées dans les contextes de recherche sur les maladies métaboliques et en oncologie.

ATP-citrate synthase Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ACLY sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

ATP-citrate synthase Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ACLY dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ACLY, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de ATP-citrate synthase. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ACLY natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de ATP-citrate synthase au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie ATP-citrate synthase dans les cellules tumorales présentant une expression de ACLY silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.