ATIII CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403735-ACT

SERPINC1 kodiert Antithrombin III (ATIII), einen in der Leber gebildeten Serinprotease-Inhibitor, der zentrale Gerinnungsenzyme wie Thrombin und Faktor Xa neutralisiert und dadurch das hämostatische Gleichgewicht aufrechterhält. Die ATIII-Aktivität wird durch Heparansulfat und pharmakologische Heparine verstärkt, wodurch SERPINC1 mit der glykosaminoglykanabhängigen Regulation der Gerinnungskaskade verknüpft ist. Veränderte SERPINC1-Expression oder -Funktion ist mit einer fehlregulierten Thrombinbildung und einer gestörten Fibrinbildung assoziiert, was SERPINC1 für die Untersuchung von Thrombophilie-Mechanismen und der Kontrolle des Gerinnungsnetzwerks relevant macht. In zellulären und systembiologischen Workflows bietet SERPINC1 einen gut untersuchbaren Knotenpunkt, um die Dynamik von Protease und Inhibitor, den Endothel–Leber‑Crosstalk sowie Schnittstellen zwischen Entzündung und Gerinnung zu analysieren.

ATIII Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SERPINC1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ATIII Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SERPINC1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SERPINC1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ATIII-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SERPINC1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ATIII-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ATIII-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SERPINC1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.