Plasmide CRISPR d'Activation (h) Atg9a: sc-408011-ACT

ATG9A code pour Atg9a, une protéine membranaire conservée à passages multiples qui fournit des membranes au phagophore en expansion lors de la macroautophagie et soutient la biogenèse des autophagosomes. Atg9a effectue une navette entre le réseau trans-Golgi, les endosomes et les sites d’initiation de l’autophagie, coordonnant le trafic membranaire avec la machinerie centrale de l’autophagie afin de maintenir la protéostasie et le contrôle qualité des organites. Par ses rôles dans le flux autophagique, Atg9a influence les réponses au stress nutritionnel, au stress du réticulum endoplasmique (RE) et les voies d’autophagie sélective qui modulent l’inflammation et le métabolisme cellulaire. Une régulation altérée d’ATG9A a été associée à une autophagie dérégulée observée en cancérologie, dans les maladies neurodégénératives et dans les interactions hôte–pathogène, ce qui en fait une cible pertinente pour des études mécanistiques de l’adaptation au stress liée aux maladies.

Atg9a Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ATG9A sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Atg9a Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ATG9A dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ATG9A, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Atg9a. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ATG9A natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Atg9a au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Atg9a dans les cellules tumorales présentant une expression de ATG9A silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.