Atg14 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402883-ACT

O gene humano ATG14 codifica a proteína Atg14, um componente central do complexo I da fosfatidilinositol 3-quinase de classe III (PI3KC3), que promove a produção de fosfatidilinositol-3-fosfato em membranas autófagas nascentes. A Atg14 ajuda a definir o início da autofagia ao direcionar o complexo Beclin 1–VPS34 para o retículo endoplasmático e para os sítios de montagem do fagóforo, sustentando a nucleação e a maturação do autofagossomo. Por meio do controle do fluxo autofágico e de vias de degradação seletiva, o ATG14 influencia a proteostase, o controle de qualidade de organelas e as respostas celulares ao estresse por privação de nutrientes. A desregulação da autofagia envolvendo o ATG14 tem sido associada a mecanismos relevantes para a biologia do câncer, a neurodegeneração e a sinalização inflamatória, tornando-o um alvo útil para investigar essas vias.

Atg14 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de ATG14 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Atg14 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus ATG14 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição ATG14, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Atg14. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus ATG14 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Atg14 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Atg14 em células tumorais com expressão de ATG14 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.