ATAD5 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-405654-ACT

Humanes ATAD5 kodiert eine AAA+-ATPase, die die Genomstabilität reguliert, indem sie während der DNA-Replikation und -Reparatur das Abladen von PCNA vom Chromatin fördert. Über diese Funktion hilft ATAD5, das Fortschreiten der Replikationsgabel, die Postreplikationsreparatur und die Bewältigung von Replikationsstress zu koordinieren und greift dabei in Signalwege ein, die während der S‑Phase die DNA-Integrität bewahren. Eine Störung der ATAD5-Aktivität kann replikationsassoziierte DNA-Schäden und chromosomale Instabilität erhöhen – Prozesse, die häufig in der Krebsbiologie und bei anderen Erkrankungen untersucht werden, die mit defekten DNA-Schadensantworten zusammenhängen. ATAD5 wird daher häufig als mechanistischer Einstiegspunkt genutzt, um replikationsgekoppelte Reparatur und Checkpoint-Signalgebung in Säugerzellen zu untersuchen.

ATAD5 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ATAD5-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ATAD5 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ATAD5-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ATAD5-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ATAD5-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ATAD5-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ATAD5-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ATAD5-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ATAD5-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.