ASS1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401923-ACT

Humanes ASS1 (Argininosuccinat-Synthase 1) kodiert ein zytosolisches Enzym, das die ATP‑abhängige Kondensation von Citrullin und Aspartat zu Argininosuccinat katalysiert – ein zentraler Schritt im Harnstoffzyklus und in der Argininbiosynthese. Durch die Regulation der Stickstoffentsorgung und der Argininverfügbarkeit beeinflusst ASS1 die zelluläre Aminosäurehomöostase, den Stickstoffmonoxid‑Stoffwechsel und die nachgeschaltete Polyaminsynthese. Eine veränderte ASS1-Expression ist mit erblichen Störungen des Harnstoffzyklus verbunden und kann die metabolischen Abhängigkeiten von Tumorzellen neu prägen, in denen häufig Arginin‑Auxotrophie sowie umprogrammierter Ein‑Kohlenstoff‑ und Nukleotidstoffwechsel beobachtet werden. Diese Eigenschaften machen ASS1 zu einem nützlichen Knotenpunkt für die Untersuchung der Regulation metabolischer Signalwege, von Nährstoffstress‑Antworten und von Genotyp‑Phänotyp‑Beziehungen in humanen Zellmodellen.

ASS1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ASS1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ASS1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ASS1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ASS1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ASS1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ASS1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ASS1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ASS1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ASS1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.