ASCL3 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-425304-ACT

Der bHLH-Transkriptionsfaktor 3 der Achaete-scute-Familie (ASCL3) ist ein basischer Helix-Loop-Helix-Regulator der Maus, der an der Festlegung von Zelllinien und an Differenzierungsprogrammen beteiligt ist, insbesondere in epithelialen und sekretorischen Zellkontexten. Durch die Bindung an E-Box-Motive und die Koordination transkriptioneller Netzwerke mit anderen bHLH-Faktoren kann ASCL3 Zellschicksalsentscheidungen, Reifung und die Aufrechterhaltung spezialisierter Zellphänotypen beeinflussen. Eine fehlregulierte Expression von bHLH-Entwicklungsregulatoren ist häufig mit veränderten Differenzierungszuständen, aberranter Proliferation und transkriptioneller Reprogrammierung verbunden, die für onkogene und metaplastische Prozesse relevant sind. Ascl3 dient daher als nützlicher Knotenpunkt, um transkriptionsfaktorgetriebene Entwicklungswege und differenzierungsassoziierte Veränderungen der Genexpression in Mausmodellsystemen zu untersuchen.

ASCL3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Ascl3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ASCL3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Ascl3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Ascl3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ASCL3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Ascl3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ASCL3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ASCL3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Ascl3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.