ASCL3 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-425304-ACT

Il fattore di trascrizione bHLH 3 della famiglia achaete-scute (ASCL3) è un regolatore murino di tipo basic helix–loop–helix implicato nella specificazione di linea e nei programmi di differenziamento, in particolare in contesti epiteliali e di cellule secretorie. Legandosi ai motivi E-box e coordinando reti trascrizionali con altri fattori bHLH, ASCL3 può influenzare le decisioni di destino cellulare, la maturazione e il mantenimento di fenotipi cellulari specializzati. Un’espressione deregolata dei regolatori dello sviluppo bHLH è spesso associata a stati di differenziamento alterati, proliferazione aberrante e riprogrammazione trascrizionale rilevanti per processi oncogenici e metaplastici. Ascl3 rappresenta quindi un nodo utile per analizzare le vie di sviluppo guidate da fattori di trascrizione e i cambiamenti dell’espressione genica legati al differenziamento in sistemi modello murini.

ASCL3 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Ascl3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ASCL3 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Ascl3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Ascl3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ASCL3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Ascl3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ASCL3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ASCL3 nelle cellule tumorali con espressione di Ascl3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.