ASC/TMS1/PYCARD Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400151-ACT

PYCARD codifica a ASC (também conhecida como TMS1), uma proteína adaptadora citosólica que nucleia a montagem do inflamassoma e faz a ligação entre recetores de reconhecimento de padrões a montante e a ativação de caspases inflamatórias. Através dos seus domínios PYD e CARD, a ASC promove a formação de “specks” de ASC, facilitando a ativação da caspase-1 e o processamento subsequente de IL-1β e IL-18, bem como a piroptose dependente de gasdermina D. A sinalização dependente de ASC integra-se com vias da imunidade inata, incluindo NLRP3, AIM2 e plataformas de inflamassoma relacionadas, moldando a defesa antimicrobiana e a inflamação estéril. A atividade desregulada de PYCARD/ASC tem sido implicada em mecanismos de doenças inflamatórias e autoimunes e é frequentemente estudada em contextos de infeção, neuroinflamação e sinalização imunitária associada a tumores.

ASC/TMS1/PYCARD O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PYCARD sem alterar a sequência de ADN subjacente.

ASC/TMS1/PYCARD O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PYCARD em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PYCARD, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de ASC/TMS1/PYCARD. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PYCARD nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de ASC/TMS1/PYCARD no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via ASC/TMS1/PYCARD em células tumorais com expressão de PYCARD silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.