ASC/TMS1/PYCARD CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400151-ACT

PYCARD kodiert ASC (auch als TMS1 bekannt), ein zytosolisches Adapterprotein, das die Assemblierung des Inflammasoms initiiert und upstream‑Mustererkennungsrezeptoren mit der Aktivierung inflammatorischer Caspasen koppelt. Über seine PYD‑ und CARD‑Domänen fördert ASC die Bildung von ASC‑Specks, was die Aktivierung von Caspase‑1 und die nachgeschaltete Prozessierung von IL‑1β und IL‑18 sowie eine gasdermin‑D‑abhängige Pyroptose erleichtert. Die ASC‑abhängige Signalübertragung ist in angeborene Immunwege integriert, darunter NLRP3, AIM2 und verwandte Inflammasom‑Plattformen, und prägt so die antimikrobielle Abwehr und sterile Entzündung. Eine dysregulierte PYCARD/ASC‑Aktivität wurde mit Mechanismen entzündlicher und autoimmuner Erkrankungen in Verbindung gebracht und wird häufig im Kontext von Infektionen, Neuroinflammation und tumorassoziierter Immunsignalgebung untersucht.

ASC/TMS1/PYCARD Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PYCARD-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ASC/TMS1/PYCARD Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PYCARD-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PYCARD-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ASC/TMS1/PYCARD-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PYCARD-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ASC/TMS1/PYCARD-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ASC/TMS1/PYCARD-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PYCARD-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.