Asbt CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402666-ACT

Das humane SLC10A2 kodiert den apikalen natriumabhängigen Gallensäuretransporter (Asbt), einen Membran-Symporter, der die aktive Aufnahme konjugierter Gallensäuren im distalen Ileum vermittelt und zum enterohepatischen Recycling von Gallensäuren beiträgt. Durch die Regulation der Größe des Gallensäurepools und der intestinalen Resorption beeinflusst Asbt die Gallensäure–FXR-Signalgebung, den Lipidstoffwechsel sowie nachgeschaltete metabolische und entzündliche Programme. Eine veränderte SLC10A2-Aktivität wird mit Phänotypen der Gallensäuremalabsorption, Diarrhö und einer gestörten Cholesterin- und Gallensäurehomöostase in Verbindung gebracht und wird häufig im Kontext der Transportphysiologie des intestinalen Epithels untersucht. Dieser Transporter ist zudem relevant für Untersuchungen der Signalübertragung entlang der Darm–Leber-Achse sowie für den Einfluss von Gallensäuren auf mikrobiomassoziierte Stoffwechselprozesse.

Asbt Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SLC10A2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Asbt Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SLC10A2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SLC10A2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Asbt-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SLC10A2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Asbt-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Asbt-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SLC10A2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.