Plasmide CRISPR d'Activation (h) ARK-1: sc-401568-ACT

AURKA code la kinase sérine/thréonine ARK‑1 (humaine), un régulateur associé au centrosome indispensable à l’entrée en mitose, à la maturation du centrosome et à l’assemblage d’un fuseau bipolaire. ARK‑1 coordonne la progression du cycle cellulaire via la phosphorylation de substrats du fuseau et associés aux microtubules, et s’intègre au contrôle du point de contrôle mitotique afin d’assurer une ségrégation fidèle des chromosomes. Une activité d’AURKA dérégulée perturbe la stabilité génomique et est fréquemment associée à des phénotypes prolifératifs et à l’aneuploïdie observés en biologie tumorale. En tant que nœud central de la signalisation liée à la mitose, AURKA est couramment utilisée pour étudier les mécanismes d’amplification des centrosomes, la dynamique du fuseau et les réponses au stress au cours de la division cellulaire.

ARK-1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de AURKA sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

ARK-1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus AURKA dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription AURKA, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de ARK-1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus AURKA natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de ARK-1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie ARK-1 dans les cellules tumorales présentant une expression de AURKA silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.