Plásmido CRISPR de Activación (h) ARHGEF5: sc-409563-ACT

ARHGEF5 codifica un factor de intercambio de nucleótidos de guanina (GEF) para Rho que activa las GTPasas de la familia Rho, conectando señales de receptores de la superficie celular con la remodelación del citoesqueleto de actina. Mediante la regulación de vías impulsadas por RhoA, ARHGEF5 influye en la adhesión, la polaridad y la motilidad celular, y contribuye a la dinámica de las adhesiones focales y a la formación de fibras de estrés. Este eje de señalización se integra con vías que controlan la proliferación y la supervivencia, lo que convierte a ARHGEF5 en un nodo útil para estudiar el control del citoesqueleto y la transducción de señales. La alteración de la regulación de las GTPasas Rho se ha asociado con fenotipos invasivos y una organización tisular aberrante, lo que respalda la investigación de ARHGEF5 en modelos relevantes de enfermedad con migración y crecimiento desregulados.

ARHGEF5 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de ARHGEF5 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

ARHGEF5 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus ARHGEF5 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional ARHGEF5, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de ARHGEF5. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo ARHGEF5 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de ARHGEF5 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía ARHGEF5 en células tumorales con expresión de ARHGEF5 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.