ARH2 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-433335-ACT

Das murine Adprhl1 kodiert ARH2, ein Mitglied der ADP‑ribosylhydrolase‑ähnlichen Familie, die an der Regulation der Dynamik der Mono‑ADP‑Ribosylierung und daran gekoppelten Signalen für den Proteinumsatz beteiligt ist. Auch wenn die enzymatische Aktivität bei einigen Familienmitgliedern atypisch sein kann, wird ARH2 hinsichtlich seiner Beiträge zu zellulären Stressantworten, metabolischer Kontrolle und Signalprozessen untersucht, die mit der Verarbeitung von DNA‑Schäden und der Redox‑Homöostase verknüpft sind. In Modellen der Herz‑ und Muskelbiologie wurde die Adprhl1‑Expression mit der Organisation der Myofibrillen und Entwicklungsprogrammen in Verbindung gebracht, was sie für Untersuchungen kardiomyopathieassoziierter Signalwege und von Mechanismen des Gewebeumbaus relevant macht. Diese Eigenschaften machen ARH2 zu einem nützlichen Knotenpunkt, um zu untersuchen, wie ADP‑Ribose‑assoziierte Signalgebung mit organspezifischer Physiologie zusammenwirkt.

ARH2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Adprhl1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ARH2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Adprhl1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Adprhl1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ARH2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Adprhl1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ARH2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ARH2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Adprhl1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.