ARFGAP1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403939-ACT

ARFGAP1 kodiert das ADP-Ribosylierungsfaktor-GTPase-aktivierende Protein 1, einen zentralen Regulator des ARF1-Zyklus, der die GTP-Hydrolyse fördert, um das Abschnüren und Entmanteln von Vesikeln im frühen sekretorischen Weg zu koordinieren. Durch die Modulation des COPI-beschichteten Transports, des Golgi–ER-Transports und der Dynamik der Membrankrümmung trägt ARFGAP1 zur Aufrechterhaltung der Golgi-Struktur und zu einer effizienten Sortierung von Frachtproteinen bei. Seine Aktivität überschneidet sich mit der Signalübertragung kleiner GTPasen und breiteren Netzwerken des Membrantransports, die das Rezeptorrecycling und die intrazelluläre Signalausgabe beeinflussen. Eine Fehlregulation des ARF-abhängigen Traffickings und der Golgi-Homöostase wurde mit Phänotypen in Verbindung gebracht, die für onkogene Signalwege, Neurodegeneration und die Ausnutzung der zellulären Transportmaschinerie durch Pathogene relevant sind, wodurch ARFGAP1 einen nützlichen Angriffspunkt für mechanistische Studien darstellt.

ARFGAP1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ARFGAP1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ARFGAP1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ARFGAP1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ARFGAP1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ARFGAP1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ARFGAP1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ARFGAP1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ARFGAP1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ARFGAP1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.