Plasmide CRISPR d'Activation (h) ARF6: sc-400799-ACT

ARF6 code une petite GTPase apparentée à Ras qui régule le remodelage de la membrane plasmique, l’endocytose indépendante de la clathrine et le recyclage des protéines membranaires, grâce à un contrôle coordonné du métabolisme des phosphoinositides et de la dynamique de l’actine. L’alternance entre les états liés au GDP et au GTP place ARF6 en amont de voies contrôlant la polarité cellulaire, le renouvellement des jonctions d’adhérence et le trafic des intégrines, influençant ainsi la migration et le comportement invasif. La signalisation d’ARF6 s’articule avec les GTPases de la famille RHO et avec des programmes associés à MAPK/PI3K qui ajustent l’organisation du cytosquelette et la disponibilité des récepteurs à la surface cellulaire. Une activité d’ARF6 dérégulée a été associée à une motilité altérée et à des phénotypes liés aux métastases dans des modèles de cancer, ainsi qu’à des défauts de morphogenèse neuronale et de trafic membranaire synaptique pertinents pour la neurobiologie.

ARF6 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ARF6 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

ARF6 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ARF6 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ARF6, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de ARF6. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ARF6 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de ARF6 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie ARF6 dans les cellules tumorales présentant une expression de ARF6 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.