ARAP3 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-405365-ACT

ARAP3 (auch als CENTD3 bekannt) kodiert ein phosphoinositidbindendes ArfGAP und RhoGAP, das die PI3K-Signalübertragung mit der koordinierten Regulation von GTPasen der ARF6- und Rho-Familie koppelt. Über seine Multidomänen-Architektur moduliert ARAP3 den Umbau des Aktinzytoskeletts, den Membrantransport, integrinabhängige Adhäsion sowie chemotaktische Antworten, insbesondere in endothelialen und hämatopoetischen Zelllinien. Die ARAP3-Aktivität greift in Signalwege ein, die Zellmigration, vaskuläre Morphogenese und inflammatorische Signalgebung steuern, und ist damit relevant für Studien zur Angiogenese und zum Leukozyten-Trafficking. Eine fehlregulierte Small-GTPase-Signalgebung und veränderte ARAP3-Expression wurden mit der Invasion von Krebszellen und dem Remodeling des Tumormikromilieus in Verbindung gebracht, was ARAP3 als Knotenpunkt für die mechanistische Untersuchung von Signalwegen unterstützt.

ARAP3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ARAP3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ARAP3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ARAP3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ARAP3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ARAP3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ARAP3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ARAP3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ARAP3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ARAP3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.