Aquaporin 2/AQP2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400402-ACT

Aquaporin 2 (AQP2) ist ein durch Vasopressin regulierter Wasserkanal, der überwiegend in den Hauptzellen der Sammelrohre der Niere exprimiert wird, wo er die transepitheliale Wasserpermeabilität und die systemische Wasserhomöostase steuert. Der Transport (Trafficking) von AQP2 zur apikalen Membran wird durch die AVPR2–cAMP–PKA-Signalübertragung sowie durch phosphorylierungsabhängige Interaktionen reguliert, die Vesikelrecycling, Membraneinbau und Endozytose modulieren. Durch die Kopplung des osmotischen Wassertransports an die epitheliale Polarität und die Funktion der Tight Junctions trägt AQP2 zu den renalen Konzentrierungsmechanismen und zur Anpassung an den Hydratationszustand bei. Eine dysregulierte AQP2-Expression, -Phosphorylierung oder -Trafficking ist mit einer beeinträchtigten Harnkonzentrierung assoziiert, einschließlich des nephrogenen Diabetes insipidus und weiterer Störungen des Wasserhaushalts, die mit einer Dysfunktion des Sammelrohrs zusammenhängen.

Aquaporin 2/AQP2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen AQP2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Aquaporin 2/AQP2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des AQP2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der AQP2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Aquaporin 2/AQP2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native AQP2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Aquaporin 2/AQP2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Aquaporin 2/AQP2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem AQP2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.