Plasmide CRISPR d'Activation (m2) APPL2: sc-432068-ACT-2

Le gène murin Appl2 code APPL2, une protéine adaptatrice endosomale contenant des domaines BAR, PH et PTB, qui relie les endosomes précoces positifs à Rab5 à la transduction du signal et au trafic membranaire. APPL2 coordonne l’endocytose médiée par les récepteurs avec des voies en aval, notamment les signalisations PI3K–AKT et MAPK, influençant la dynamique du cytosquelette, la migration cellulaire et les réponses aux facteurs de croissance. Des altérations de la signalisation de la famille APPL ont été associées à la régulation du métabolisme, à la sensibilité à l’insuline et à des réseaux de signalisation liés au cancer, faisant d’Appl2 une cible pertinente pour étudier le contrôle, dépendant des endosomes, de l’homéostasie cellulaire. L’édition du gène Appl2 dans des systèmes murins permet une dissection mécanistique des fonctions d’échafaudage de l’endocytose, des interactions entre voies de signalisation et des relations génotype–phénotype en biologie cellulaire et en recherche sur des modèles de maladies.

APPL2 Le plasmide d'activation CRISPR (m2) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Appl2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

APPL2 Le plasmide d'activation CRISPR (m2) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Appl2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Appl2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de APPL2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Appl2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de APPL2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie APPL2 dans les cellules tumorales présentant une expression de Appl2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.