APPL1 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-428481-ACT

Mouse Appl1 kodiert APPL1, ein endosomales Adapterprotein, das die Dynamik Rab5-positiver früher Endosomen mit der Signaltransduktion stromabwärts von Rezeptortyrosinkinasen koppelt. APPL1 ist an der PI3K–AKT-Signalgebung, an Insulin- und Adiponektinantworten sowie an der Modulation von MAPK- und NF-κB-assoziierten Signalwegen beteiligt – über Protein-Protein-Interaktionen, die den vesikulären Transport mit transkriptionellen Outputs koordinieren. Durch diese Funktionen ist APPL1 für Studien zur metabolischen Homöostase, Insulinsensitivität, Entzündung und Kontrolle des Zellwachstums breit relevant. Eine Fehlregulation der APPL1-gekoppelten Signalgebung und endozytischen Sortierung wurde in Modellen metabolischer Erkrankungen und veränderter proliferativer Signalwege beschrieben, wodurch Appl1 ein nützlicher Knotenpunkt für die Untersuchung von Signalwegen in vivo und in kultivierten Zellen ist.

APPL1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Appl1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

APPL1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Appl1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Appl1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen APPL1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Appl1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von APPL1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des APPL1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Appl1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.