APOBEC3B CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401700-ACT

APOBEC3B kodiert eine Cytidin-Deaminase, die einzelsträngige DNA editiert, indem sie Cytosin in Uracil umwandelt, und so zur intrinsischen antiviralen Abwehr sowie zur Restriktion von Retroelementen beiträgt. Seine Aktivität steht in Wechselwirkung mit DNA-Replikations- und Reparaturprozessen, einschließlich Antworten auf Replikationsstress und der Verarbeitung mutagener Läsionen, und prägt dadurch genomweite Mutationsmuster. Eine dysregulierte APOBEC3B-Expression ist mit einer erhöhten somatischen Mutationslast und charakteristischen APOBEC-Mutationssignaturen in mehreren Tumorarten assoziiert. Daher wird APOBEC3B häufig in Signalwegen untersucht, die Genomstabilität, angeborene Immun-Signalgebung und mutationsgetriebene Anpassung steuern.

APOBEC3B Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen APOBEC3B-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

APOBEC3B Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des APOBEC3B-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der APOBEC3B-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen APOBEC3B-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native APOBEC3B-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von APOBEC3B-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des APOBEC3B-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem APOBEC3B-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.